PCR Nedir

PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ya da PCR (Polymerase Chain Reaction)

PZR, DNA’nın nükleik asit dizisi bilinen iki bölgesinin arasında kalan bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan, labratuvar ortamında yapılan bir tekniktir. Kary Mullis tarafından 1980’lerde geliştirilmiştir. Bu teknik ile istenen DNA dizisi milyarlarca kez çoğaltılabilir. Kısaca kalıp DNA zincirinin iki zinciri yüksek sıcaklıkta birbirinden ayrılır. Zincirin birinin bir ucuna uyumlu nükleotid dizisine sahip primer bağlanır. Ortamdaki nükleotidleri genetik şifreye uygun olacak şekilde polimeraz enzimi yardımyla birbirine ekler. Primer bu şekilde uzadıkça çoğaltılması hedeflenen DNA dizisi de sentezlenmiş olur (Şekil 1).  

 


 


 

Sekil 1. PZR’nin çalışma mekanizması

 

PZR Karışımının İçeriği

1. Kalıp DNA: Çoğaltılması hedeflenen diziye sahip DNA örneği.

2. dNTP’ler: Serbest nükleotidler (adenin, timin, quanin, sitozin). Bu nükleotidler çoğaltılması hedeflenen bölgeye ait yeni DNA zincirlerini  kurarken kullanılırlar.

3. Primerler: “Forward” ve “reverse” olarak 2 primere ihtiyaç vardır. Çoğaltılması hedeflenen dizinin iki ucunda da yeni zincirin sentezi için başlangıç noktası gibi davranır.

4. Tampon çözelti: İçinde PZR reaksiyonunun gerçekleşmesi için optimal pH’a sahip çözelti.

5. Polymeraz: Çoğaltılması hedeflenen DNA zincirini sentezleyecek olan enzim. Genellikle Thermis aquaticus’dan elde edilen yüksek sıcaklıklara dayanıklı Taq polimeraz kullanılır.

6. MgCl2 Çözeltisi: Enzim ile ortak factor olan Mg2+ iyonlarını sağlar. Bazı tampon çözeltilere direk eklenmıştır. Bazen ise ayrıca PZR karışımına eklemek gerekir. Magnezyum iyonlarının konsantrasyonu enzimin diziyi ne kadar hızla ve doğru olarak çoğaltacağını etkiler.

7. Distile Su: Reaksiyon çözeltilerinin optimal hacme getirmek için kullanılır.

 

PZR’nin Aşamaları (Şekil 1 ve 2)

Bu reaksiyon termocyclar ad verilen ani sıcaklık değişimleri yapabilen hassas cihazlarda gerçekleştirilir (Şekil 3).

1. Adım: 90-95 ºC: Bu adım polimeraz enzimini aktive eder.

2. Adım: 90-95 ºC? Bozulma (Denatürasyon): Yüksek sıcaklık iki zincirli DNA’nın iki zincirinin birbirinden ayrılmasını sağlar. Böylece, PZR karışımı içindeki etmenler genetik bilgiye ulaşabilir.

3. Adım: 55-65 ºC? Bağlanma (Annealing): Daha düşük sıcaklıktaki bu adımda primerler çoğaltılması hedeflenen bölgelere bağlanabilirler. Bu adım PZR reaksiyonunun en kritik basamağıdır. Cünkü yeni zincirin sentezlenmesi primerlerin bağlanması ile başlayacaktır.

4. Adım: 72ºC civarı ?Sentez (Synthesis): Enzimin çalışması için optimum sıcaklıkta olur. dNTP’ler polimeraz enziminin etkisi ile birbirlerine bağlanırlar ve primerlerin uzamasıyla yeni kopya da uzar.

2., 3. ve 4. Adımların Tekrarı: ?Bozulma-primer bağlanımı ve sentez adımlarının tekrarı. Burada birden çok yeni kopya DNA zinciri oluşur. Kopyaların sayısı herbir döngüde katlanarak artar (Şekil 1)

5. Adım: 72 ºC civarı? Uzama (Extention): Reaksiyonun durmasından önce zincirlerin tümünün sentezinin tamamlanması için gereken bir adımdır.

6. Adım: 4 ºC:? Isının düşmesiyle enzimin aktivitesi biter, dolayısıyla reaksiyon da durur.

 


Şekil 2. PZR'nin aşamaları                             Sekil 3. PZR'nin gerçekleştiği termocyclar cihazı

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 























   EN | TR

PROJE NO: TUBİTAK-KBAG 114Z894